신약개발을 위한 인간화마우스의 연구 동향

유대열 / 한국과학기술한림원 정회원, 지에이치바이오(주) 기술고문

1.     인간화마우스 개발의 필요성

동물모델은 의과학 연구, 특히 인간 질환의 병인 연구는 물론 신약 개발을 위한 비임상 연구에 아주 중요한 연구자원이다. 이중 마우스는 해부학적 유전 학적으로 인간과 유사한 면이 많고 크기가 작아 관리하기 용이하며 연구자가 쉽게 이용할 수 있어 다양한 용도의 동물모델로 의과학 연구에 중요한 역할 을 하여 왔다. 그러나 마우스와 인간은 대사 및 면역학적인 측면에서   근본적 으로 달라, 마우스연구 결과를 인간에 곧 바로 적용하는데 한계가 있다. 이러 한 점에서 인간과 가장 가까운 동물인 영장류를 신약개발에 활용하고 있으나, 영장류는 고가이고 특히 윤리적인 면에서 접근하기가 어렵다는 단점이 있다. 이상을 고려할 때, 기능성 인간 세포 또는 조직으로 이식된 마우스인 인간화 마우스 (humanized mice)는 소동물의 생체 내 환경 하에서 인간 세포와 조 직의 기능과 발달에 대한 연구를 가능하게 하는 고유한 장점을 지니고 있다. 그동안 다양한 범주의 인간화마우스를 개발하기 위해, 면역시스템 성분, 간세 포, 피부조직, 췌장소도, 자궁내막, 그리고 신경세포를 포함하는 각종 인간 세 포와 조직이 마우스에 이식되어 왔고, 이들 중, 기능성 인간면역시스템 성분 들로 이식된 인간화 면역 시스템을 지닌 마우스는 인간화마우스의 원형으로 가장 널리 연구에 활용되고 있다.

우리나라도 대학, 출연연 및 기업의 일부 연구실에서 면역부전마우스를 이 용한 인간화마우스 연구에 관심을 갖고 있으며 연구가 활발히 진행 중에 있 다. 그동안 인간화연구를 위한 면역부전마우스는 대부분 미국과 일본으로부터 수입에 의존하고 있었으나 최근 본사를 비롯한 일부 기업에서 국산화가 진 행되어 연구현장에서 활용되고 있다. 인간세포를 지닌 인간화마우스는 국내에 서 확보하기 어려워 대부분 외국으로부터 수입에 의존하고 있으며 상당히 고 가이므로 일반 연구자들이 접근하기 어려운 실정이다. 따라서 우리나라가 신 약개발 및 의과학 연구를 활성화하기 위해서는, 비임상 모델로써 인간화마우 스 개발연구가 절실한 상황이다.

본 글에서는 면역부전마우스와 이 면역부전마우스를 이용한 인간화마우스 의 개발 및 연구 활용 현황을 살펴보며, 우리나라의 비임상 마우스모델의 연 구개발 및 활용의 활성화를 기대한다.

2.     면역부전마우스의 개발 동향

면역부전마우스의 역사를 살펴보면 (표 1), 1962년 T 세포가 결손된 누드 마우스가 첫 번째 면역부전마우스이다. 누드마우스는 BALB/c마우스 사육 중 자연발생적으로 태어나는데, 실험동물로 연구 개발되어 오늘날도 전 세계적으 로 유용하게 활용되고 있다. 1983년 T세포와 B세포가 결손된 중증복합형 면 역 부전증 [severe combined immnunodeficiency (SCIDs)]을 일으키는 S CID 마우스가 두 번째 면역부전마우스로 발견되었고 인간조혈모세포 (Huma n Hematopoietic Stem Cells; HSCs)의 이식이 가능하나 효율이 낮아 이를 개선하기 위해 NOD/ShiLtSz마우스와 교배하여 생산된 NOD-SCID마우스가 1995년 개발되었다. 하지만 NOD-SCID마우스는 선천적인 면역체계가 아직도 남아 있어 인간조혈모세포의 이식율의 향상을 위한 연구가 필요하였다. T세 포가 완전히 결손 되었거나, 결손이 심한 것이 특징인 인간의 X-연계된 중증 복합면역부전증 (X-SCID)은 IL-2 Receptor γ 체인 유전자가 돌연변이된 것 으로 알려져 있다. 이점을 착안하여 NOD-SCID마우스에서 IL-2 Receptor γ 가 결손(knockout)된 면역부전마우스를 만들기 위해, NOD-SCID마우스와 IL-2 Receptor γ^-/- 마우스를 교배한 결과, T세포, B세포는 물론 NK세포가 거의 완전히 결손된 것이 확인되었다. 이 방법으로 NOG 및 NSG마우스가 200 2년과 2005년 개발되었고, 오늘날 대표적인 중증 면역부전마우스로 전 세계 적으로 널리 연구에 활용되고 있다. 한편 1992년 Rag2의 결손에 의해 T세포 와 B세포가 결손된 BALB/c 마우스가 개발되었고, 2004년 Rag2^-/-마우스에 IL-2 receptor γ 유전자가 결손되어, NSG/NOG 마우스처럼 B, T, NK세포 가 결손된 BRG마우스가 개발되었다. 최근 본연구팀도 유전자교정기술에 의해 NOD-SCID마우스에 직접 IL-2 receptor γ 유전자를 결손시켜 NSG마우스와 거의 똑같은 면역부전현상을 보이는 NIG면역부전마우스를 제작하여 국내 연구 현장에 공급하고 있다.

이처럼 면역세포 인간화를 위한 면역부전마우스가 다수 보고되어 있지만 지면 관계로 본고에서는 연구현장에서 널리 활용되고 있는 마우스를 중심으 로 더 자세하게 설명하고자 한다.

[표 1] 면역부전마우스의 개발사

가. 누드마우스

누드마우스는 1962년 Norman R. Grist와 1966년 Flanagan에 의해 발 견되었고 (Charles River 자료), 또한 1968년 Pantelouris의 보고에 의하면 누드마우스는 태어나면서부터 일생동안 털이 없고 흉선 (thymus)이 완전히 결여되어 있음이 확인되었다. 누드마우스는 T 세포가 결핍되어 있고, 무흉선 인 동형접합체 (homozygotes) 마우스는 면역시스템에 많은 결점이 있는데, 즉, 림프절과 비장의 흉선 의존적 부위로부터의 림프구 (lymphocytes)가 고 갈되어 있고, 거의 대부분 B세포로 구성되어 있는 림프구 군도 상당 수준 줄 어들어 있으며, 흉선 의존적 항원에 비교적 정상적인 IgM 반응을 보이고 있 고, 동종 그리고 이종 피부 및 종양의 이식을 거절할 수 없는 점을 포함하여 흉선 의존적 항원에 매우 나쁜 반응을 보일 뿐만 아니라 감염에 크게 증가된 감수성을 보이고 있다 (Gershwin 등, 1975; Pantelouris, 1973; Rygaard, 1973; Rygaard and Povlsen, 1974). 이형접합체 (heterozygotes) 마우스 (nu/+)는 털이 있으며 유사유전자형 (congenic) 대조군 마우스 (+/+)처럼 50

-80% 크기의 흉선을 지니고 있다.

유전학적으로 누드마우스는 상염색체 열성 (autosomal recessive)으로, 처 음에는 nu로 기술되었으며, 돌연변이된 유전자가 HNF-3/forkhead 상동 11 유전자에 있는 것으로 확인되었고, 2000년 돌연변이된 유전자가 Fox 유전자 가족 (family)의 하나로 확인되어 Foxn1nu로 업데이트 되었다. FOXN1 유전 자결손 마우스는 누드 표현형을 보인다. 누드 암컷은 유선 발달이 저하되어 새끼에게 젖을 줄 수 없으므로 누드 수컷을 이형접합 암컷과 교배하여 육종 한다. 동형접합 누드마우스 새끼는 생후 24시간 안에 코수염이 없거나 코수 염의 상태 (구부러짐)가 안 좋아 정상과 구별될 수 있다. nu/nu마우스의 생 존을 극대화하기 위해서는 정상 한배새끼 (littermates)를 골라 빼놓는 것이 좋다 (ILAR, 1989).

누드마우스의 수명은 6-12개월이고, 무균 (germ free) 환경에서는 정상마 우스와 비슷하게 살 수 있다. 동형접합 nu/nu 마우스는 광범위한 세균 및 바이러스 병원체에 의한 감염에 매우 민감하여 isolator, micro-isolator, la minar flow cabinet 또는 병원체가 없는 환경에서 사육되어야 한다.

누드마우스는 인간 고형암 (solid tumor)의 연속적인 이식 (serial transpl antation)에 유용한 것으로 일찍부터 알려졌고, 그 형태적 기능적 특성은 연 속적인 이식기간 중에 잘 보존되어 있다고 한다 (Sordat 등, 1975). BALB/c-nu가 다른 누드마우스에 비해 비교적 종양이식이 잘 되는 것으로 알려져 있다 (Dagnæs-Hansen 등, 1992). 그러나 인간 소화기암의 종양 발달율은 CBA/N, NSF/N and NIH 누드마우스와 비교하여 BALB/c-nu 가 더 낮은 것으로 알려졌다 (Maruo 등, 1982). 이처럼 누드마우스는 T세포가 결핍되어 있어 악성종양세포의 이식에 널리 사용되어 왔지만, 백혈병 또는 림프종과 같 은 혈액암의 이식에는 적합하지 않다. B세포와 선천적인 면역세포 (innate i mmune cells)를 지니고 있어 주로 인간정상세포의 이식을 허용하지 않으며, 자라는 속도가 느리거나 원발성 종양세포 또는 이종 (heterogeneous) 종양 조각의 이식에도 적당한 모델이 아니다. 그리고 일반적으로 간암세포인 Hep G2 세포를 누드마우스에 이식하면 종양형성이 되지 않는 것으로 알려져 있으 며, 폐암세포인 A549 세포를 피하 이식해도 종양형성이 매우 저조하다 (Kwo n 등, 2015).

나. SCID마우스

중증복합형 면역 부전증 [severe combined immnunodeficiency(SCID s)]을 일으키는 돌연변이마우스 (SCID 마우스)는 1983년 Bosma 등에 의해 CB17마우스 계에서 발견되었다. 중증복합형 면역 부전증은 DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (PRKDC) 유전자의 돌연변이로 일어난다. PRKDC는 DNA 의존적 protein kinase의 촉매 subunit를 코딩하는 유전자 로, DNA 수복 (repair) 그리고 T세포 수용체 (T Cell Receptor: TCR) 및 면역글로블린 (Immunoglobulin: Ig) 유전자의 체세포재조합 (somatic reco mbination) 동안 일어나는 이중가닥절단 (double strand break)을 봉하는 역할을 한다. 따라서 PRKDC단백질이 없으면, T세포 수용체와 면역글로블린 유전자가 재편성 (rearrange) 되지 못해, 결과적으로 마우스는 B 및 T세포가 결핍된다. SCID마우스는 림프구 전구세포를 지니고 있으나, 이들 세포는 성 장하지 못하므로 흉선에서 B 및 T 세포를 생성하지 못한다. PRKDC단백질은 DNA 수복에 관여하기 때문에 SCID마우스는 방사선 (radiation)에 민감하여 방사선조사가 필요한 실험인 경우 적합한 모델이 아니다. CB17-SCID마우스 는 인간 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells: PBMC) 와 인간 조혈모세포 (Hematopoietic stem cells: HSCs)의 이식이 가능하지만 인간 HSCs의 접종을 방해하는 NK세포, 마크로파지, 과립구 (granulocyt es)를 지니고 있어 이식율이 낮다. 이러한 문제점을 개선하기 위해 NOD-SCI D 마우스가 개발되었는데, 이 마우스는 CB17-SCID 마우스를 NOD/ShiLtSz 마우스와 교배하여 만든 것이다 (Shultz 등, 1995). NOD/ShiLtSz backgro und는 제1형 당뇨모델 (a polygenic model for type 1 diabetes)으로, 털 색은 흰색이다.

다. NOD-SCID 마우스

위에서 언급한 바와 같이 NOD-SCID마우스는 CB17-SCID 마우스를 NO D/ShiLtSz 마우스와 역교배하여 만들었고 NOD.CB17-Prkdcscid/J라고 명 명되었다. 이 NOD-SCID 마우스는 선천적인 면역체계 (innate immune sys tem)가 약화되었다. 즉, NK세포 활성이 줄어들었고, 마크로파지 기능이 제대 로 발휘되지 못하였다. 이 결과, CB17-SCID 마우스에 비해 인간 HSCs와 P BMC 이식율이 높아졌다 (Hesselton 등, 1995; Lowry 등, 1996; Pflumio 등, 1996). 수명은 흉선 림프종 (thymic lymphomas)으로 8-9개월 정도이나 당뇨병은 유발되지 않는다. 털색은 흰색이다.

라. Rag 1^-/- 마우스

Rag1은 면역글로블린과 TCR 유전자들의 V(D)J recombination 반응을 활성화하거나 촉매하는 기능을 지니고 있어, Rag1^-/-마우스는 B세포 및 T세 포를 포함하고 있지 않고, 단지 작은 림프기관 (lymphoid organs)을 지니고 있다 (Mombaerts 등, 1992). SCID 마우스가 나이가 들면 누출현상 (leaky) 으로 약간의 B세포와 IgM을 생산하는 반면, Rag1^-/- 마우스는 non-leaky하 여 림프구가 존재하지 않는다.

마. Rag 2^-/- 마우스

Recombination activating gene 2 단백질 (Rag2)은 Rag2 유전자에 의 해 인코드된 림프구 특이적 단백질이다. Rag 1과 함께, Rag2는 VDJ recom binase를 이루는데, 즉, 면역글로블린과 T세포 수용체 유전자들의 가변부가 발달하는 B 및 T세포에 결집되는 동안, VDJ recombination과정에 필요하 다. Rag 2^-/- 마우스 (Shinkai 등. 1992)는 SCID 마우스에서 관찰된 leakiness와 방사선감수성 (radiosensitivity)이 보이지 않는다. 따라서 Rag 2 유전 자의 기능 상실은 T 세포, B세포를 결실한 마우스를 생산하기 충분하다.

바. NSG/NOG/NIG마우스

IL-2 Receptor γ chain은 IL-2, IL-4,   IL-7, IL-9, IL-15 그리고 IL-2

1 receptors의 기능에 필요한 수용체 단백질로, IL-2 Receptor γ가 결손되 면, 다른 사이토카인들의 기능이 발휘되지 못한다. NK세포가 생성되기 위해 서는 IL-7과 IL-15에 의한 신호전달이 중요하며, IL-2 Receptor γ가 결손되 면, 이 NK세포는 생성되지 않는다. 따라서 NOD-SCID마우스에 남아있는 NK 세포뿐만 아니라 T세포, B세포까지 완전히 결핍된 면역부전마우스가 다음과 같이 개발되었다.

Ⓒ NOG 마우스

일본 실험동물중앙연구소 (CIEA)가 NOD/Shi-scid 마우스와 C57BL/6J-I L-2Rγnull 마우스 (exon 7부터 exon 8까지 neomycin 저항 cassette와 교 체됨)를 교배하여 만든 마우스를 NOD/Shi-scid 마우스와 계속 역교배하여 만든 congenic 마우스 (NOD/Shi-scid IL2rgnull) 이다 (Ito 등, 2002). T, B, 그리고 NK 세포가 만들어지지 않는 마우스이고, leakiness와 자연발생적 인 흉선 림프종도 생기지 않는다. 따라서 이 마우스는 인간세포의 이식에 의 한 증식과 분화연구에 아주 유용한 최상의 면역부전마우스이므로, 암, 감염, 재생 및 혈액 등의 인간 질환의 치료연구에 널리 이용되고 있다.

Ⓒ NSG 마우스

미국 Jackson Lab이 NOD/LtSz-scid 마우스와 IL2rg null 마우스(exon

3 일부로부터 exon 8까지 neomycin 저항 cassette와 교체됨)를 교배하여 만든 마우스를 NOD/LtSz-scid 마우스와 계속 역교배하여 만든 congenic마 우스 (NOD/LtSz-scid IL2rgnull) 이다 (Schultz 등, 2005). T, B, 그리고 N K 세포가 만들어지지 않는 마우스다. 일본 CIEA가 만든 NOG마우스와 똑같 은 면역부전마우스이다.

Ⓒ NIG 마우스

본 연구팀이 CRISPR/CAS9 기법으로 제작한 면역부전마우스다. 즉, NO D.CB17/PrkdcSCID-JKrb마우스의 수정란에 IL-2 Receptor γ 유전자 gRN A와 CAS9을 미세 주입함으로써 유전자교정기법으로 IL-2 Receptor γ 유전 자 2bp가 결손된 마우스다 (Bak 등, 2020). 이 NIG마우스는 IL-2 Receptor γ 유전자가 발현되지 않았으며 혈액과 비장세포를 추출하여 T, B, 그리고 N K cell의 성분을 조사한 결과, T, B, 그리고 NK 세포가 검출되지 않았고, 이 마우스 피하에 HepG2 세포를 이식한 결과, 종양이 잘 자라고 있음을 확인하 였다. 반면, 대조군 마우스 (누드마우스 및 NOD-SCID마우스)는 종양이 형성 되지 않았다. 또한 Raji 세포와 A549 세포를 이식한 결과도 HepG2 세포를 이식한 결과와 유사하게 NIG 마우스에서 종양 형성이 잘 되었으나 대조군 마 우스에서는 종양이 잘 자라지 않았다. 이상의 암세포 이식 실험결과, NIG 마 우스는 NSG 마우스와 아주 유사한 면역부전마우스임을 확인하였다.

사. BRG 마우스

BALB/c마우스에 Rag2 및 IL-2 receptor γ gene이 결손된 마우스이다 (Traggiai 등, 2004). 따라서 BRG 마우스는 T세포와 B세포의 결핍뿐 아니라 NK세포도 상당 수준 결핍되어 있다.

아. NRG 마우스

NOD-Rag 1^-/-마우스와 NOD-SCID- IL2 receptor γ ^-/-마우스를 교배 하여 만든 마우스로 (Pearson 등, 2008) B세포 및 T세포가 결핍되어 있고, 또한 기능성 NK세포도 결핍되어 있는 마우스다.

3.     면역부전마우스의 인간화모델 연구

가. 인간화마우스의 발달

태아 간과 흉선의 이식에 의해 인간 T 및 B세포를 받은 SCID마우스 (Mc Cune 등, 1991;1988)를 SCID-hu마우스라고 명명하였는데, 이 마우스는 다 양한 분야의 연구에 매력적인 인간화마우스로 제공되었으나, 이식율이 높지 않았다. 2000년대 개발된 NOG, BRG, NRG, NSG마우스는 아주 높은 비율의 이식과 인간 세포의 분화를 보여주어 인간질환모델의 발달에 상당한 진전을 가져왔다. 축적된 데이터에 의해, NOG/NSG마우스가 인간화된 조직과 인간 세포이식에 가장 적합한 모델이라고 확인되었고, 아래 순서와 같이 이식이 잘 된다고 한다: NSG=NOG>NRG>BRG>NOD-SCID (Pearson 등, 2008; Brehm 등, 2010).

이들 인간화마우스의 가장 매력적인 면은 인간 조혈모세포의 이식에 의한 다양한 계열의 조혈 세포들의 발달이다. 특히, NOD-SCID마우스에서 분화될 수 없는 CD4 및 CD8 단일포지티브세포를 포함하는, T세포의 부분 모집단 (subpopulation)들이 이 인간화마우스에서는 잘 발달한다. 이러한 결과들은 인간면역반응을 연구하는데 인간화마우스가 유용하다는 것을 의미하며, 실로 인간화마우스는 전 세계적으로 연구자들에 의해 잘 활용되고 있다. 그러나 이 들 인간화마우스들은 인간세포들이 완전히 기능적이지 않기 때문에 인간화마 우스로 충분하지 않다. 예를 들면, 항원을 다수 주입하면 항원 특이적 IgG 생 산이 전혀 없거나 아주 드물게 일어난다. 또한, NOG/NSG마우스는 인간조 혈모세포의 이식에 널리 활용되고 있지만 림프구세포 만의 인간화로 선천성 면역체계를 반영하지 못한다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 이들 면역부전마우스를 기반으로 다양하게 개선된 계통 (strains)이 개발되었는데 그들 마우 스를 살펴보면 다음과 같다.

Ⓒ NOG-EXL 마우스

Ito 등 (2012)은 B6 계통의 hGM-CSF/IL-3 Tg (transgenic)마우스를 역 교배로 NOG마우스 계통으로 전환시킴으로 hGM-CSF/IL-3 Tg NOG 마우스 (NOG-EXL)를 만들고 인간세포 (CD34+)를 이식한 결과, NOG 마우스보다 골 수 세포가 3배 많아 이식율이 높은 것을 알 수 있었고, 이식 후 약 7개월까 지 생존하지만 빈혈이 발생하는 단점이 있다.

Ⓒ hIL-2 또는 4 Tg NOG마우스

Ito 등 (2012)은 또한 NOG 수정란에 DNA를 주입함으로써 인간 IL-2 또 는 IL-4를 분비하는 Tg NOG마우스를 개발하였다. hIL-4 Tg NOG마우스에서 Th2 세포들로의 지배적인 전환과 이식편대숙주병 (GVHD) 억제, 그리고 hIL-2 Tg NOG마우스에서 인간 NK세포의 상당한 분화가 관찰되었다.

Ⓒ NOG-IL-15 마우스

hIL-15를 발현하는 NOG형질전환마우스이다. 이 마우스는 인간 PBMC 이 식 후 NK세포를 충분히 반영하였으며 GVHD 증상 없이 7개월까지 생존하였 다 (Katano 등, 2017).

④ HLA Tg NSG 마우스

Schultz그룹은 HLA class I Tg마우스를 NSG마우스에 역교배함으로 HL A class I Tg NSG 마우스를 제작하였다. 이 마우스에서 항원특이적인 세포 독성 T 세포가 잘 생성됨을 관찰하였다. 항원 특이적인 IgG도 HLA class II Tg NSG 마우스에서 생산되었다.

Ⓒ NSG-SGM3 마우스

Wunderlich 등 (2009)은 human GM-CSF, IL-3, KITLG가 발현하는 N SG마우스 (NSG-SGM3)를 만들었는데, 초생리적인 수준의 사이토카인이 발현 되었고 CD34+ cell 이식 효율이 높았고, 이식 후 4개월까지 생존하였으나 빈 혈이 심하였다.

⑥ SRG 마우스

Rag2^-/-IL2Rg^-/- BALB/c (BRG) 마우스에서 인간 SIRPα 유전자가 녹인(K nock-in)된 마우스이다. SIRPα (signal regulatory protein-α)는 마크로파 지와 수지상세포에 존재하는 단백질로, CD47의 리간드로 작용하며, CD47과 의 결합을 통해, “don`t eat me” signal (phagocytosis inhibition) cascad e를 개시한다. 따라서 인간 CD47과 약한 결합을 보이는 BALB/c마우스의 SI RPα 대신에 강한 결합을 보이는 인간 SIRPα로 대체한 SRG마우스는 Rag2^-/-IL2Rg^-/-마우스보다 인간 암세포 이식효율이 더 좋은 마우스이다.

Ⓒ BRGSF 마우스

BALB/c마우스에서 Rag2^-/-, IL2Rg^-/-, Flk2^-/-, 그리고 NOD마우스의 SIR Pα를 발현하는 마우스로, NOG/NSG마우스처럼, Prkdc 돌연변이가 없으므 로, SCID마우스의 부작용인, 방사선에 대한 고도의 민감성, T세포 누출 (lea kage), 그리고 흉선림프종의 형성이 보이지 않는 장점이 있다. 또한 NOD마 우스의 SIRPα가 발현되므로 인간조혈모세포의 이식율이 향상되고, 마우스의 생존기간이 길다 (GenOway home page). 이는 NOD 마우스의 SIRPα가 다 른 스트레인에 비해 65배나 강하게 인간 CD47과 결합하므로 인간 암세포 이 식에 좋은 환경을 제공하기 때문이다. NOD SIRPα/hu-CD47 결합은 hu-SI RPα/hu-CD47 결합보다 10배나 강하다 (Kwong 등, Immunol. 2014).

⑧ MISTRG 마우스

Rag2^-/-IL2Rg^-/- BALB/c와 129 마우스의 유전적 배경 하에 Rag2^-/-, IL2Rg^-/-, 그리고 인간 GM-CSF, 인간 IL-3, 인간 M-CSF 및 인간 Tpo, 또 한 인간 SIRPα 유전자가 녹인되어 있는 마우스이다 (Saito 등, 2016). NSG 마우스보다 골수세포가 6배 많아 인간세포의 이식이 탁월하며 생존기간이 길 지만 빈혈이 생긴다.

나.  혈액/림프 (HematoLymphoid)  인간화마우스의 특성

인간 조혈계 시스템의 재구성은 인간화마우스연구에 가장 앞선 분야중 하 나이다. NOG/NSG 또는 BRG 마우스를 사용하여 인간 조혈기능이 현저하게 향상되었다. HSCs를 함유하는 인간 CD34+   세포 집단을 NOG/NSG 또는 B RG 마우스에 이식하면, T, B, NK 림프계 세포, 마크로파지 및 수지상세포를 포함하는 인간면역시스템의 가장 중요한 성분들의 발달을 볼 수 있다.

Ⓒ  림프계  (Lymphoid)  세포

NOG/NSG마우스에 방사선처리 후 인간 HSCs를 주입함으로써 주요 림프 계세포인 T 및 B세포들이 발달되었다.

1)     B 세포 : 인간화마우스의 비장에서 두드러진 B세포 표현형은 인간 B세 포와 달리 CD5발현이 높은데 (Matsumura 등, 2003), 그 것이 미치는 영 향에 대해서는 의견이 분분하다.

2)     T 세포 : NOG/NSG 인간화마우스 또는 BRG 인간화마우스의 흉선에서 인간 T세포들이 발달하고 비장에서 축적된다. 이는 부분적으로 인간 T세 포의 분화를 지원하는 NOD-SCID 마우스와 다른 중요한 점이다. 인간화마 우스의 발달은 비교적 정상이지만, 인간화마우스 T세포의 기능은 의견이 분분하다. 비정상적인 T세포 기능에 관한 작용기전은 명확하지 않지만, 마 우스 MHC와 donor 인간세포 HLA 사이의 불일치점이 관련된 것으로 보 고 있다. 실로, HLA-A 또는 HLA-DR이 발현하는 NSG 마우스는 바이러 스 감염에 정상적인 세포독성 반응을 보였고 또한 외래 항원에 대해서도 정상적인 IgG반응을 보였다 (Danner 등, 2011; Schultz 등, 2010; Strow ig 등, 2009).

3)     NK세포 : 인간 NK세포는 HSC 주입 한 후 4주 경에 발달하지만, NK세 포 수는 아주 높지 않다. 이는 면역부전마우스에서는 성장 및 분화인자가 필요하다는 것을 암시한다. IL-2 Tg NOG 마우스에서 HSC를 주입 후, 인 간 NK 세포가 B 및 T세포들보다 우세하게 발달하였다 (Katano 등, 201 5).

4)     NK세포와 T 세포 : SRG-15마우스는 Rag2^-/-IL2Rg^-/- 마우스의 유전 적 배경 하에 human signal regulatory protein alpha (SIRPA)와 hum an interleukin 15 (IL15)이 녹인 되어 있는 마우스이다. SRG-15 마우스 에 인간 조혈모세포 (hematopoitic stem and progenitor cells)를 이식 하면 순환 중이고 조직에 내재된 인간 NK 및 CD8 (+) T세포의 발달과 기 능이 극적으로 성숙되었고, 조직에 내재된 선천성 림프계 세포 (innate ly mphoid cell; ILC)의 발달이 촉진되었다 (Herndler-Brandstettera 등, 2 017).

Ⓒ  골수  (MyeLoid)  세포

종래의 인간화마우스에서 인간 골수세포의 분화를 볼 수 있지만, 그 효율 은 나쁘다. 그러나 최근, 인간 사이토카인을 도입한 마우스를 이용함으로 다 양한 계의 골수세포가 발달되었다.

1)      단핵세포 (Monocytes) : hGM-CSF/IL-3 Tg NOG 마우스에서 CD14 (+) 단핵세포를 포함하는, 인간 골수세포의 발달이 증가되었다.

2)     수지상세포 (DCs) : hGM-CSF/IL-3 Tg NOG마우스에서 수지상세포의 발달이 증가되었다.

3)     과립세포  (GranuLocytes)  :  hGM-CSF/IL-3  Tg  NSG  마우스의  골수에 서 인간 CD15+   과립세포의 발달이 약간 증가되어 있었다 (Billerbeck 등, 2011). TPO KI (knock-in) 마우스 골수에서도 다수의 인간 CD66b (+) 과립세포가 생산되었다 (Rongvaux 등, 2011). 그리고 hGM-CSF/IL-3 Tg NOG마우스의 골수와 말초혈에서 인간 CD66b+과립세포수가 증가되어 있음을 확인하였다.

4)     비만세포  (Mast  ceLLs)  :  NOG  인간화마우스의  골수,  비장,  피부에서  인 간비만세포가 존재함을 밝혔는데, 이들 세포들은 c-kit와 CD203c에 양성 이었지만 FceR의 발현은 되지 않았다. 최근 hGM-CSF/IL-3 Tg NOG마우 스의 골수, 비장 그리고 몇몇 비림프계 조직에서 FceR가 발현하는 비만세 포를 확인하였다.

다. 질환연구를 위한 인간화마우스 모델

Ⓒ 암

NOG/NSG마우스는 종양의 성장속도가 빠르고 여러 번 계대한 후에도 특 징을 잘 유지한다. 그러나 원발성 인간종양세포는 항상 NOG 마우스에서 이 식되는 것은 아니다. 전립선암과 같은 종양세포는 SCID나 누드마우스에서 이 식이 어렵지만, NOG 마우스에서도 어렵다. 그 이유는 아직 명확하지 않으나 종래의 면역부전마우스에 세포주의 적응이 다르기 때문인 것으로 예견되고 있다. NOG 마우스의 다른 특징은 전이가 빈번하게 일어난다는 것이다. 종양 에 대한 면역반응을 연구하기 위한 모델이 최근 발달되었다. 종양세포와 다른 donor의 HSC로부터 온 조혈세포 사이의 HLA의 불일치로 인해 심각한 이식 편대숙주병 (graft versus host disease;GVHD)이 일어나거나 반응이 결핍된다. 마우스에서 종양세포에 대한 효과적인 면역반응을 유도하기 위해, 최근 S chultz 등 (2010)은 다음과 같은 실험을 하였고 긍정적인 결과를 얻었다. 즉, HLA class I (A-2) Tg 마우스에 HLA가 부합된 HSC를 주입하였더니 항원 특이적 세포독성 T 림프계 세포가 성공적으로 유도되었다. 또한 이식편대숙 주병의 유발을 최소화하기 위해 NSG/NOG마우스의 MHC class I/II 유전자 를 결손시킨 마우스가 개발되었고 (Michael A 등, 2019; Tomonori Yaguc hi 등, 2018), NOG-dKO 마우스에 PBMC를 주입하고 종양을 유도한 다음, 면역관문저해제를 투여하여 항암효능을 확인한 결과도 보고되어 있다 (Tadas hi Ashizawa 등, 2017). 또한 NSG-b2m^−/−마우스에 PBMC를 주입하고 고 형암세포를 이식하여 종양을 유도한 후 항암제인 Bintrafusp alfa를 투여하 여 항암효과를 확인한 논문도 있다 (Maurice Morillon II 등, 2020).

Ⓒ 감염질환

감염질환은 인간화마우스를 가장 광범위하게 사용한 의과학 연구분야이다. 많은 병원성 미생물은 단지 인간 및 인간과 가까운 영장류에 감염하므로, 그 들 미생물의 감염에 의한 소동물 모델을 개발하는 것은 어렵다. HSCs를 주 입한 인간화마우스에서 T 및 B세포를 포함하는 인간 림프계세포가 주로 발달 한다. 그러므로 림프계세포를 특이적으로 감염시켜 병변을 일으키는 HIV-1, HTLV-1, 그리고 EBV와 같은 바이러스에 아주 적합한 모델로 제공되고 있 다. HIV-1에 대한 유일무이한 모델로는 BLT 마우스가 주목 받고 있다 (Dent on 등, 2008; Oleson 등, 2011; Choudhary 등, 2012). 이 모델은 태아골 수, 간 그리고 흉선을 신장의 피하에 이식함으로 만들어졌는데, 이 BLT마우 스의 가장 매력적인 면은 인간 점막면역이 재구성되었다는 점이다. IL-2Rγ 유전자가 점막 림프계 시스템의 발달에 필수적인 것으로 알려졌다.

말라리아백신 개발에 적합한 동물모델이 아주 긴요한데, 인간 간세포가 이 식된 인간화마우스가 개발되어 있다. Plasmodium falciparum이 이 hu-live r 마우스의 간에서 증식하는 것이 관찰되었지만 (Mikolajczak 등, 2011), 인 간 적혈구가 복강 내로 잘 주입되어야만 한다. 왜냐하면 인간 적혈구가 HSC s로부터 발달하지 않기 때문이다 (Jimenez-Diaz 등, 2009). 마우스 모델에서 말라리아의 온전한 생활사가 이루어지기 위해서는 인간 적혈구세포가 마우스 말초혈에 지속적으로 흘러야만 한다. 그런 모델마우스의 개발이 필요하다. h u-liver 마우스는 HBV 및 HCV 감염모델로 제공되고 있다 (Bissig 등, 2010; Haridass 등, 2009; Washburn 등, 2011).

Ⓒ 이식편대숙주병 (GVHD)

GVHD의 연구를 위해 C.B-17-SCID 또는 NOD-SCID 마우스가 사용되어 왔으나 여러 가지 문제점이 있었다. 예를 들면, 인간세포이식은 마우스의 선 천면역시스템으로 말미암아 비교적 낮은 수준이었고, 거의 치사량에 가까운 방사선조사가 필요하여 질병발생시점에 큰 변화가 있었다. 더군다나 질병을 유도하기 위해 비교적 다수의 hPBMCs가 정맥 내가 아니라 복강 내 주입되 어야만 했다 (Martino 등, 1993). 그런데, 이종-GVHD NOG 마우스모델을 사용하여 질병의 조속한 개시, 숙주의 균일한 죽음과 같은 유의적인 진전이 있었다. 또한 더 적은 수의 donor 세포 (2.5 X 10⁶)의 정맥주사로 충분하였 고 방사선의 전신조사가 항상 필요하지 않았다 (Ito 등, 2009). 정리하면, NO G 또는 NSG 마우스는 현재 GVHD 연구에 가장 적합한 모델이다.

④ 인간화 간 모델

인간과 마우스의 간의 효소들은 서로 많이 다르므로, 마우스 간을 인간 간으로 대체한 인간화 간 모델이 인간 간에서의 약물대사를 평가하는데 유용 하다. Mercer 등 (2001)에 의해 처음 개발된 인간화 간 모델인 Alb-uPA S CID/bg 마우스는 심각한 저섬유소원혈증 (hypofibrinogenemic) 상태를 일 으켜 간세포 사멸을 유도하였다. 인간간세포를 하부비장극 (inferior splenic pole)에 이식하였을 때, 약 50%가 이식되었다. 인간 간세포의 이식율을 높이 기 위해 NOG-uPA (Suemizu 등, 2008) 및 FRG 마우스 (Azuma 등, 2007) 가 개발되었고, 약 80% 이상의 인간 간세포가 교체되었다. 그럼에도 불구하 고, 낮은 번식률, 신장질환의 증가, 이식에 매우 좁은 시간과 같은 여러 가지 문제로 사용이 제한되었다. Hasegawa등 (2011)은 Alb/TK Tg NOG 마우스 를 만들고 ganciclovir를 처리하여 TK를 발현하는 간 실질세포를 없애고 사 람 간세포를 이식한 결과, 80% 이상이 이식된 것을 확인하였고, uPA의존 마 우스에서 보였던 간질환, 신장질환, 그리고 출혈특성이 나타나지 않았다. Azu ma 등 (2007)은 Rag2 ^-/-/IL-2Rγ^-/-마우스에 FAH^-/-마우스를 교배하여 FRG (FAH^-/-/Rag2 ^-/-/IL-2 Rγ^-/-) 마우스를 제작하였다. FAH (fumaryl acetoa cetate hydrolase)는 임신된 마우스 태아 16일부터 간과 신장에 발현하는 데, 간세포에 FAH가 결손되면 독성물질인 fumaryl acetoacetate가 축적되 어 간 손상을 일으키므로 tyrosine의 fumaryl acetoacetate로의 변환을 제 어하는 NTBC [2-(2-nitro-4-trifluoromethylbezoyl)-1,3-cyclohexanedion e]를 계속 투여하여 fumaryl acetoacetate의 축적을 막아야 한다. 따라서 F RG 마우스는 음용수에 NTBC를 계속 처리해주면 잘 자라고 번식도 잘된다. FRG 마우스에 urokinase를 발현하는 adenovirus를 처리하면 인간 간세포 를 90%까지 이식할 수 있는 것으로 알려져 있다. 한편 Alb-uPA SCID/bg 마우스의 단점을 보완하고 인간 간세포 이식율을 높이기 위한 연구 결과도 보고되었다. Tateno 등 (2015)은 cDNA uPA가 마우스 albumin Promoter/ enhancer에 의해 발현되는 마우스를 제작하고 인간 간세포를 이식한 결과, 혈중 인간 알부민이 Alb-uPA SCID/bg 마우스의 2.9내지 1.6배 높았고 Alb-uPA SCID/bg 마우스의 단점이 유의성 있게 해소되었으며, B형 및 C형 간염바이러스에 의한 감염도 잘 되는 모델이다. 이처럼 획기적인 인간화 간 모델이 만들어진 이유는 uPA의 발현 수준을 Alb-uPA SCID/bg 마우스보다 대폭 낮춘 결과로 설명되고 있다. 본 연구팀은 NIG 마우스의 FAH가 결손된 마우스와 cytosine deaminase가 발현하는 NIG마우스를 제작하여 인간 간세 포가 이식되어 B형 간염바이러스가 감염되고 간염치료제를 처리했을 때 감염 된 바이러스가 줄어드는 결과를 얻었으며 (국내특허등록 2022), 인간 간세포 의 이식율을 향상시키는 연구를 진행 중에 있다.

4.     향후 전망

신약개발에 있어서 실험동물에 의한 비임상 효능검정 및 독성평가는 매우 중 요한 것으로 알려져 있지만, 비임상 실험 결과가 임상에 그대로 반영되지 못하여 FDA의 승인을 얻지 못하는 경우가 많아 비임상 실험모델의 신규 개발이 절실한 상황이다. 그동안 마우스가 중요한 실험동물로써 연구와 비임상 실험에 널리 사 용되어 왔지만, 사람과 면역시스템 및 대사시스템에 있어서 상호 차이로 인해 마 우스의 실험결과가 임상에 그대로 적용되지 못하고 있는 경우가 많아 마우스의 단점을 보완한 인간화마우스가 대안으로 떠오르고 있다.

지금까지 면역부전마우스를 이용하여 다양한 인간화마우스가 개발되었고 연구현 장에서 사용되고 있는데 인간화마우스는 마우스의 단점을 보완해줄 수 있을 것으 로 기대되고 있으나 보다 개량된 인간화를 위한 작업은 지속적으로 필요한 실정 이다. 향후 암 등 질환치료를 위한 신약개발은 더욱 활성화될 것이고 이에 따라 비임상 실험은 더욱 중요해질 것으로 예상되어 인간화마우스는 더욱 주목을 받을 것으로 생각된다.

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