BRIC View 2023-T22

면역항암제의 효능평가를 위한 차세대 PBMC 인간화마우스 개발 동향

유 대 열

지에이치바이오(주)

E-mail: dyyu@gh-bio.com

목   차

1.   서론

2.   본론

2.1.   면역부전마우스를 이용한 유용한 인간화마우스 연구동향

2.2.   이식편대숙주병 저감 인간화마우스 모델의 개발

2.2.1.  PBMC-NSG (NOG) 마우스를 이용한 면역세포 인간화

2.2.2.  PBMC-NSG-MHC-class I/ II 결손 마우스를 이용한 면역세포 인간화

2.2.3.  PBMC-NOG-MHC-dKO 마우스를 이용한 면역세포 인간화

2.2.4.  GVHD 저감 PBMC 인간화마우스 제작에 있어서 고려 사항

2.3.  PBMC 모델에 있어서 보다 효율적인 면역세포의 이식 및 생존을 위해 고려되어야 할 사항

2.3.1.  NK 세포

2.3.2.   골수세포

2.4.   맞춤의료에 있어서 인간화 모델

2.5.  PBMC 인간화 모델 연구에 대한 미래 방향

3.   결론

4.   참고문헌

1.   서론

면역요법은 암환자들에게 전례 없는 항암효과를 보여주었지만, 10-30%의 일부 환자들에게 치료 효과가 있고 나머지 환자들에게는 반응이 없거나 미미하여, 면역항암제의 치료 효과를 향상시 키고 내성을 극복하며 바이오마커를 확보하는 동시에, 독성을 줄이는 연구개발이 절실한 상태이다. 면역항암제의 비임상 평가를 위해 신뢰성 높은 마우스 모델이 필요한데, 그 중에서 인체면역세포가 함유되고 인체 암조직이 이식된 인간화마우스가 유망한 후보로 떠오르고 있다. 암면역치료를 위해 이상적인 모델은 임상에서 사용 중인 면역항암제의 작용기전을 이해하는 데 사용될 수 있고, 새로운 면역요법의 우선순위를 매기며 병용치료 효과를 테스트하는 도구로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 임 상 반응을 예측할 수 있는 모델이어야 한다 [1]. 이러한 예측은 신약의 임상중개를 단축하거나 재발 기에 맞춤치료를 조정하는 데 도움이 될 것이다. 그렇지만 인간화마우스 모델이, 치료 가이드로써 사용되기 위해서는, 환자의 면역시스템과 암과의 상호작용을 설명할 수 있어야 한다. 그러나, 실상 인간화마우스는 이 목적을 단지 부분적으로 충족하고 있을 뿐이다. 필자는 이 지면을 통해 이용 가 능한 인간화마우스에 대한 최신 지견을 제시하고, 특정 연구를 위해 가장 적절한 모델을 선정하는 데 도움을 주기 위해서는 어느 정도의 인간화마우스가 인간의 질환을 모델링할 수 있는지, 그리고 향후 기술개발 방향에 대해 설명하고자 한다.

2.   본론

2.1.   면역부전마우스를 이용한 유용한 인간화마우스 연구동향

인간화마우스 모델은 인체면역세포를 함유한 면역부전마우스에 인체 암세포의 이종이식(Cell Line Derived Xenografts, CDXs), 그리고 원발성 고형암조직 또는 환자 유래 혈액세포의 이종이식 (Patient-Derived Xenografts, PDXs)에 의한 접종에 의해 만들어지고 있다. 인체면역세포를 지닌 면역 부전마우스, 즉 면역인간화마우스는 인체 CD34+ 조혈모세포(Hematopoietic Stem Cells, HSCs) 또는 말초혈액단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)를 이식하여 제작되는데, CD34+ 인간화 마우스는 여러 가지 면역계, 즉 T 세포, B 세포, 수지상세포 그리고 골수세포가 발달하여 [2], 이식편 대숙주병(Graft-versus-Host Disease, GVHD) 증상이 적게 일어남으로 안정적으로 장기간 인간화된다 는 장점이 있어, 장기간 분석이 필요한 인체 암 모델의 생물학적 평가에 적합하다 [3]. 한편 PBMC 인간화마우스는 주입된 PBMCs에 의해 GVHD 증상이 유도됨으로, 치료 관찰 기간이 4-5주로 줄어들 뿐만 아니라 인체 T 세포 집단의 기능적 평가를 교란시킬 수 있다. 하지만, 인체 PBMC 접종은 인체 의 성숙한 T 세포의 기능 조사를 가능하게 하므로, 성숙한 면역 시스템의 기능을 검사하는데 적합하 고, 또한 PBMC 공여자와 종양조직의 HLA가 일치되면 항원 특이적 반응을 검사하는데도 적합한 모델이다.

인체면역세포 이식이 가능하게 된 첫 번째 인간화마우스는 1988년 protein kinase DNA-acti- vated catalytic polypeptide (prkdc)가 돌연변이 된 CB17-SCID 마우스의 발견에 의해 가능하게 되었 다 [4, 5, 6]. CB17-SCID 마우스는 T 및 B 세포가 결핍되어 있어 보통 인체 세포의 이식이 가능하다. 1995년 마우스 선천성면역시스템을 줄이기 위해, SCID마우스를 nonobese diabete (NOD) 마우스와 교배하여 NOD/SCID 마우스가 개발되었다 [7]. 이 마우스는 CB17-SCID 마우스에 비교하여, NK세포, 마크로파지 그리고 보체 시스템의 결핍이 축적되어, 인체면역성분의 재구성이 5배나 향상되었다 [8]. 이런 모델의 대안은 Rag1 및 Rag2 유전자가 결손된 마우스이다. 이 마우스는 T 및 B 세포의 수용 체 생산에 필요한 VDJ (variable-diversity-joining) 재구성(recombination)을 방해하여, T 및 B 세포 발 달과 생존이 차단된다 [9].

다음으로 진보된 인간화마우스를 만드는 데 필요한 면역부전마우스는 IL-2 receptor γ chain (IL2rg) 유전자 적중 마우스의 개발에 의해 2002년에 이루어졌는데, 마우스 NK 세포가 완전 결핍된 마우스다 [10, 11, 12]. 이들 마우스는 중증면역부전마우스로 기존의 마우스보다 상당히 높은 수준의 인체조혈모세포 이식을 도와주어 기능적인 인체면역시스템의 발달을 가능케 하였다. 이들은 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG), NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), 그리고 C;129S4- Rag2tm1.1FlvIl2rgtm1.1Flv/J (BRG) 마우스이다. NOG 마우스는 IL2rg 체인의 세포질 도메인이 결손되어 사 이토카인을 결합하는 데 필요한 신호를 줄 수 없고, NSG 및 BRG 마우스는 IL2rg 체인이 완전히 결 손된 표현형을 지니고 있다. 이들 3계통의 마우스는 인체조혈모세포의 이식을 허용하지만, NOD 배 경의 계통은 선천면역세포가 결핍되어, BRG 마우스보다 더 높은 수준의 인체 세포 이식이 가능하다. 또한 본 연구팀이 Crispr/cas9 기법으로 제작하여 연구현장에 공급하고 있는 NIG 면역부전마우스가 있다. 즉, NOD.CB17/PrkdcSCID-JKrb 마우스의 수정란에 IL-2 receptor γ 유전자의 gRNA와 cas9을 미 세 주입함으로써 유전자교정기법에 의해 IL-2 receptor γ 유전자 2bp가 결손된 마우스로 NSG 마우스 와 흡사한 면역부전마우스이다 [13].

BALB/c 및 C57BL/6에 비해, NOD 마우스는 signal regulatory protein alpha (SIRPα)에 유전다 형성(polymorphism)을 지니고 있어 인간 CD47과의 친화력이 증가되어 있고, SIRPα/CD47 상호작용 에 의해 마우스 마크로파지에 의한 인체 세포의 식세포작용(phagocytosis)이 저해된다 [14]. 따라서 인간 또는 NOD 마우스의 SIRPα가 BALB/c (BRGS, SRG, 그리고 MISTRG 계통) 및 C57BL/6 (B6RGS) 마우스의 유전적 배경 하에 발현되면, 인체 조혈모세포 이식률이 증가한다 [15-18].

마우스에서 인체면역시스템을 재구성하는 것은 주로 3가지 접근법에 의해 이루어진다: Ⓐ인체 PBMC 면역인간화 모델; Ⓑ 인체 CD34+ HSC 면역인간화 모델; Ⓒ 그리고 BLT (bone marrow-liver-thymus) 모델이다. 이들 모델은 각각 특징이 있는데 가장 인간화된 모델은 BLT 모델이지만 제 작하기가 매우 어렵기 때문에 주로 PBMC와 CD34+ 모델이 사용되고 있다. 본 총설에서는 우선 연구 현장에서 접근하기 용이한 PBMC 면역인간화 모델에 대해 소개하고자 한다.

앞에서 언급한 것처럼 NOG/NSG 마우스를 이용한 PBMC 인간화 모델의 강점은 마우스 제 작이 쉽고 빠르다는 점이다. PBMC 이식 후 2주가 되면, 인체면역세포들이 혈중에서 검출되고 3주 안에 말초혈액에 인체 면역 성분이 관찰된다. 골수세포, NK 세포, 그리고 NK T 세포들의 일부는 수 일에서 수주 간 남아있지만 대부분은 적절한 생존 신호(survival signals)가 없어 사라진다. 따라서 사 이토카인을 외인성(exogenous) 또는 유전자 도입으로 발현시키면, 그들의 생존에 도움을 줄 수 있다. PBMC 인간화 모델의 약점은 접종된 PBMCs에 의해 GVHD 증상이 일어나 치료반응을 관찰할 수 있 는 폭이 4-5주로 제한된다는 점이다. 따라서 PBMC 인간화 모델은 GVHD 증상 분석, T 세포의 기능 을 보고자 하는 면역관문저해제(immune check-point inhibitors: ICIs)의 효능 평가, 또는 T 세포 부착 이중항체(bispecific T cell engager) 단독 또는 병용치료 효과를 평가하는 데 주로 적합하다. PBMC 모델의 도전과제는 PBMC 공여자가 서로 다르기 때문에 각 PBMC에 대한 면역 반응 분석 결과가 공 여자 간에 차이가 있다는 점이다.

2.2.   이식편대숙주병 저감 인간화마우스 모델의 개발

PBMC 인간화마우스 모델을 개발하는 데 있어서 한 가지 과제는 GVHD의 발생과 이에 따른 어떤 생물학적 측정에 대한 영향을 해결하는 것이다. GVHD의 발달은 심하든 약하든 활발한 반응으로, 면역 반응 조절에 대한 어떤 마우스 라인을 조사하더라도 추가 변수가 된다. NSG, NRG, 그리고 NOG 라인들은 모두 선천적으로 마우스 MHC를 발현하고 PBMC 모델에서와 같이 HLA에 의해 제한 받는 인체 T 세포가 존재하면 이종 이식에 대한 MHC 불일치가 일어나 GVHD 발달을 초래한다. CD8+ T 세포는 PBMC 인간화마우스에서 GVHD를 야기하는 반면, CD4+T 세포 단독으로는 이러한 질환을 일으키기에 충분하지 않다 [1]. 치명적인 GVHD의 발달은 인간화마우스 모델에 있어서 주요한 제한적 요소 중 하나이다. 인체 PBMC를 이식한 NSG 마우스는 특히 인젝션 후 3- 4주가 지나면 급성 GVHD의 징조가 나타난다. 따라서 면역부전마우스에서 마우스 MHC를 제거하여 GVHD를 지연시키는 다양한 라인들이 만들어졌다 (표 1).

2.2.1.  PBMC-NSG (NOG) 마우스를 이용한 면역세포 인간화

NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스를 이용한 PBMC 모델은 PBMC 이식 전 적어도 4시간 전에 100 cGy의 방사선조사(irradiation)를 주어 마우스의 골수세포를 제거하여 인체 PBMC의 인간화를 향상시킨다. 이때, 마우스 당 5×106-2×107 PBMCs를 복강 내 주사 또는 꼬리 정맥주사로 주입한다. NSG (NOG) 마우스는, 방사선조사 후 PBMC 이식하는 경우, 2-3주령부터 GVHD가 심해 추가 실험을 할 수 있는 범위가 적어, 대부분 방사선조사하지 않고 PBMC 이식하는 경우가 많다. 방사선조사하지 않는 경우도, PBMC 이식 후 4주령이면 혈중 hCD45가 30% 이상 되고 6주령이면 60% 가까이 되어 대부분의 마우스가 GVHD 현상으로 죽는다 [19]. 따라서 PBMC 면역인간화 실험에 NSG/NOG 마우스는 생존기간이 짧기 때문에 항암제 효능평가하기에는 적합치 않아, GVHD가 저감 되고 생존기간이 긴 마우스가 필요하게 되었다.

2.2.2.  PBMC-NSG-MHC-class I/ II 결손 마우스를 이용한 면역세포 인간화

King 등 [20]은 NSG 마우스에서 급성 이종이식에 의한 GVHD가 발달하는 동안 성숙한 인체 T cell에 의해 인식되는 주요 성분이 마우스 MHC class I 및 II 항원임을 규명하였다. 이 결과를 토대로 MHC 유전자가 결손된 NSG 마우스가 제작되어 PBMC 이식한 결과, NSG MHC class I 결손 마우스는 NSG 또는 NSG MHC class II 결손 마우스와 비교하여 GVHD가 지연되는 것을 알았고, 이는 인체 CD8+ T cells이 GVHD 질환의 잠재적인 발병인자임을 의미한다 [21].

이상의 연구배경 하에 Brehm 등 [19]은 NSG 마우스 MHC class I [K, D, beta-2 microglobulin (B2M)] 유전자와 MHC class II (IA, IE) 유전자를 녹아웃시킨 마우스, 즉, NSG-(Kb Db)null (IAnull), NSG- B2Mnull (IA IE)null, NSG-B2Mnull 마우스를 만들고, 이들 마우스에 방사선 조사 없이 인체 PBMCs (10 X 106, 복강 주입)를 이식함에 따라 GVHD가 거의 사라지고 T cell의 기능이 보유되는 것을 확인하였다. PBMC 이식에 따른 생존기간을 확인한 결과, NSG-(Kb Db)null (IAnull) > NSG-B2Mnull (IA IE)null > NSG-B2Mnull >NSG 순으로 마우스 MHC class I과 II가 결손된 NSG 마우스가 생존기간이 긴 것을 확인하였다. 한편 Morillon 등 [22]은 NSG-b2m⁻/− PBMC 모델에서 이중 기능을 지닌 면역치료제로 혁신신약인 Bintrafusp alpha의 항암효과를 검증하였다. 즉, NSG-b2m⁻/− 마우스에 1 × 107 PBMCs을 IP 주사하고 1주일 후 5 × 106 (HTB-1) 인체 방광암세포를 피하 주사한 다음 매주 1회씩 Bintrafusp alpha를 4주 연속 투여하고 1주 후 종양 크기를 조사한 결과, 대조군에 비해 종양 크기가 유의성 있게 감소하였고 이는 인체 CD3 T 세포의 증가로 확인되었다. 이 결과는 NSG- b2m⁻/− 마우스가 인체 PBMCs 이식에 의한 항암효능평가에 유용한 마우스임을 제시한 것이다. B2m의 결손은, 신생 Fc수용체(FcRn)가 없는 것과 연관되어, 순환하는 항체의 안정성이 저하되는 결과를 초래하므로, 항체 기반의 면역치료제의 효과를 조사하는 어떤 연구에서도 고려되어야 한다.

2.2.3.  PBMC-NOG-MHC-dKO 마우스를 이용한 면역세포 인간화

NOG 마우스를 이용한 PBMC 모델의 단점을 개선하기 위해 NOG 마우스의 MHC Iab (class II)와 B2M (class I) 유전자를 녹아웃시킨 NOG-dKO 마우스가 개발되었다 [23]. 이 마우스에 방사선조사 없이 마우스 당 5 × 106 PBMCs를 주입하였더니 4개월 이상 체중 감소가 없었고 여러 장기, 특히 간과 신장에 T 세포(CD3)의 침윤이 NOG 마우스보다 유의성 있게 서너 배 적은 것을 확인하였다. 그만큼 GVHD가 덜 생긴 것으로 판단된다. 또한, Crispr/cas9기법으로 B2M 유전자를 녹아웃시킨 B2M KO 마우스와 Iab KO 마우스와의 교배에 의해 생산된 NOG-dKOem 마우스에 방사선 조사 없이 2 × 106 human PBMCs 주입한 경우, 3개월 이상 심한 체중 감소나 사망이 관찰되지 않았다 [24].

Ashizawa 등 [25]은 방사선 조사한 PBMCs NOG-dKO 마우스에 인체 림프종(lymphoma)세포(SCC-3) 또는 인체 교모세포종(glioblastoma) 세포(U87)를 피하 이식한 후 인간 PD1 항체의 항암효능평가를 실시한 결과, 대조군에 비해 약 50% 이상 종양 크기가 줄어든 것을 확인하였다. 이 결과는 PBMC 이식 후 8주에 종양과 비장의 시료를 채취하여 얻은 결과로, PBMC 모델도 면역항암제 등의 평가에 활용될 수 있음을 제시한 것이다.

2.2.4.  GVHD 저감 PBMC 인간화마우스 제작에 있어서 고려 사항

이상 살펴본 바와 같이 마우스 MHC class I/II 유전자가 결손된 NSG (NOG) 면역부전 마우스를 이용한 PBMC 인간화마우스가 개발되어, 면역세포 인간화에 따른 GVHD 저감 정도, 생존기간 및 종양세포 이식에 따른 면역항암제 등의 항암효과가 보고되었다 (표 1). 이들 면역부전 마우스를 이용한 면역세포 인간화를 위해서는 적절한 방사선조사(irradiation) 또는 부설판(busulfan) 처리에 의한 골수절제(myeloablation)와 적당한 수의 PBMC의 주입이 중요하다. Brehm 등 [19]은 마우스 MHC class I (Kb Db)과 II(IA)가 결손 된 NSG-(Kb, Db)-/- (IA) -/- 마우스에 방사선 조사 없이 10 X 106 PBMCs를 주입하였을 경우, 125일까지 생존하였으며, NSG(B2M-/-) (IA, IE)-/-마우스도 같은 조건에서 생존기간이 125일이나 되었다. NSG-B2M-/- 마우스도 같은 조건에서 50-70일 생존하였고, 이들 마우스들은 PBMC 이식 후 4-8주령이 되었을 때, 혈중 인체 CD45가 20-25% 정도로 면역세포 인간화가 되었다. 한편, NSG-B2M-/- 마우스에 1 X 107 PBMCs를 주입하고 HTB1 방광암세포를 이식한 후 Bintrafusp alpha의 항암효과를 볼 수 있었는데, 이 경우, PBMC 이식 후 5주령에 혈중 인체 CD45가 약 30%로 항암 실험에 충분한 기간 생존하는 것을 알 수 있었다 [22].

표 1. GVHD 저감 PBMC 인간화마우스 제작에 있어서 공여자 PBMC 수와 면역 인간화 정도의 비교 분석

NOG-dKO 마우스의 경우, 방사선조사 없이 5 X 106 PBMCs를 이식한 경우, 4개월 이상 생존하였고, 이때 혈중 인체 CD45가 낮은 수준이었지만 526 melanoma 세포를 이식하고 자가 TIL (Tumor Infiltration Lymphocyte)을 주입한 경우, 항 종양 효과를 볼 수 있었다. 한편, Ashizawa 등 [25]은 방사선 조사한 NOG-dKO 마우스에 1 X 107 PBMCs를 이식한 경우, 6-8주령 마우스의 혈중 인체 CD45 함량이 30% 정도였고 10주 이상 생존하는 것을 확인하였고, 인간 PD1항체의 항암효과를 확인할 수 있었다.

이상의 결과를 종합하면, MHC class I/II KO 면역부전마우스는 PBMC 이식 후 4주령에서 8주령 사이 혈중 인체 CD45의 함량이 20 내지 30%를 유지함으로 적당한 면역세포인간화를 유지할 경우, GVHD가 저감 되어 장기간 생존하고 종양세포 이식에 따른 항암 실험을 충분히 수행할 수 있는 유용한 인간화마우스인 것으로 판단된다.

2.3.   PBMC 모델에 있어서 보다 효율적인 면역세포의 이식 및 생존을 위해 고려되어야 할 사항

인간화마우스는 GVHD뿐만 아니라 중요한 결핍이 많이 존재한다; 즉, 1) 골수 이식의 결여, 2) 항원제시세포의 제한된 활성, 3) 불량한 NK 및 NK T 세포의 생존, 4) 림프절 및 종자 중심(germinal center) 형성의 결여, 5) B 세포 클래스 전환(class switching)의 결여, 6) FOXP3 조절(regulatory) T 세포의 낮은 빈도. 이러한 문제점들이 정상적인 NSG/NRG/NOG 마우스의 변이를 이용하는 CD34+ HSC 모델에서 설명되었지만 [1], PBMC 모델에서는 이러한 정상적인 라인들의 효과를 연구한 논문이 결여되어 있어, 일부 보고된 논문을 토대로 기술하고자 한다.

2.3.1.  NK 세포

NK 세포는 IL2 및 IL15의 종 특이성 때문에 주로 NSG/NRG/NOG 마우스에서 크게 결핍되어 있다. 인간과 마우스 IL15은 65% 상동성이 있고 [26], 반면 마우스 IL2는 인체 세포에 아무런 영향을 주지 못한다 [27]. NK세포는 생존을 위해 구조적인 IL2와 효율적인 활성 및 증식을 위해 IL-15이 필요하다 [28-30]. PBMC 인간화마우스에서 순환하는 인체 T 세포는 NK 세포 생존을 위해 적당한 양의 IL2를 생산하는 것 같으나 인체 골수 성분이 없으므로 인간 IL15 생산이 충분치 않고 NK 세포 수가 줄어들어 있다. Chen 등 [31]에 의한 연구에서, 플라스미드의 꼬리 정맥 주입을 통해 인간 IL15을 발현시켰더니 HSC이식 마우스의 말초에서 NK 세포 수와 활성이 증가되었고, 중요하게도, 추가로 인간 사이토카인을 발현시켰더니 골수세포 빈도와 기능이 증가되었다. 최근 인간 IL15 결핍을 극복하는 NSG hIL7/hIL15 녹인(knockin) 마우스가 생산되었고 HSC 이식에 따른 인간 NK 세포의 빈도와 기능성을 향상시켜 주었다 [32]. 면역암 연구 설정(setting)에 있어서 PBMC 모델에서의 인간 IL15 보강에 대한 연구가 일부 있었고, 그럼에도 불구하고 HIV 문헌을 보면 PBMC 인간화마우스를 이용하는 연구를 통해 IL15 superagonist에 반응하여 NK 활성뿐만 아니라 perforin과 granzyme이 증가된 것을 알 수 있다 [33]. 이 연구는 인간 IL-15을 추가하면 인간 NK 활성과 생존이 증가한다는 것을 증명해 주지만, 공여자(donor) PBMC에서 낮은 빈도의 NK 세포는 인간화마우스의 NK 성분을 충분히 구성하는데 잠재적인 제한 요소가 된다. 추가로 분리된 자가(autologous) NK 세포 또는 NK92, 또는 높은 결합력(avidity)을 지닌 NK (haNK)를 주입하는 것이 NK 이식과 면역 암 설정의 활성화에 도움이 될 것으로 보인다 [29, 34, 35].

2.3.2.   골수세포

PBMC 인간화마우스는 낮은 빈도의 인체 골수세포를 보이고, 시간이 지날수록 본래 집단의 노화와, 자가복제(self-renew)의 실패, 또는 생존과 확대에 필요한 적당한 사이토카인 환경의 결여로 인해 인체 골수세포는 더 감소한다. NSG-SGM3 마우스는 NSG 마우스에서 인간 IL3, GM-CSF, 그리고 SCF를 발현하는 형질전환마우스이다. 제대혈에서 분리한 CD34+ 세포를 이식한 NSG-SGM3 동물은 심리적으로 관련된 숫자의 인간 단핵구(monocytes), 과립구(granulocytes), 호중구(neutrophil) [36], 수지상세포(DCs), 조절 T 세포(regulatory T cell) [37], 그리고 NK 세포 [38, 39]가 발달하는데, 이들은 모두 이식된 NSG 마우스 스트레인에서 크게 저하되어 있거나 없다. 불행하게도 이들 마우스는 심한 빈혈/백혈구 감소가 발달하였고 전구세포(progenitor cell)의 탈진을 보였으며, 생존과 면역 수명을 감소시켰다. 그 대신, 인간 PBMC를 이식한 NSG-SGM3 동물은 빈혈과 백혈구 감소증상이 줄어들었는데 이것은 PBMC 이식한 동물의 수명이 GVHD의 발달로 짧아졌기 때문인 것으로 보인다. 뿐만 아니라, PBMC 이식된 NSG 라인에 비해, PBMC 이식된 NSG-SGM3 모델에서 높은 이식률과 골수세포 및 FOXP3 조절 T 세포의 생존율을 예상하지만, 아직 이 모델은 온전히 특징지어지지 않았다 [1]. 짧은 기간의 비교인 만큼, 동일한 공여자의 PBMC로 이식한 NSG와 NSG-SGM3 동물 사이의 세포 수준에서의 차이에 대해 보고된 논문이 별로 없으나, 저자들은 면역치료 조절에 반응하여 PBMC 이식된 NSG-SGM3 동물에서 보다 임상적으로 영향력이 있는 사이토카인이 생산된다고 보고하였다 [40]. 추가 연구를 통해, PBMC 이식된 NSG-SGM3 동물에서의 면역치료 조절은 인간화 플랫폼을 사용한 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome)의 발달을 예상하거나 연구하는데 유용한 플랫폼으로 제공될 것이다.

2.4.   맞춤의료에 있어서 인간화 모델

NSG/NRG/NOG 마우스의 MHC 발현을 제거하면 인간 면역세포 이식에 따른 GVHD가 지연되어 면역이식이 더욱 관용을 얻게 된다. 그러나, 마우스 MHC가 없으면, 마우스 조직에 대한 이종 반응을 완전히 방지할 수는 없다. 서로 일치하는 인간 MHC 발현을 통한 자기 인식의 실패는 아직도 우려스러울 정도의 염증반응을 초래한다. 마우스 MHC class I 또는 II가 제거되고 그 자리에

인간 HLA class I 또는 II를 발현하는 마우스가 추가로 만들어졌다. 면역 암연구 설정에 있어서 이들 마우스를 사용하는 것은 Class I 또는 II의 녹아웃과 발현에 의해 제한되어 왔는데, 이는 단지 단일수정위치(single modified locus)에 내구성이 있는 관용(durable tolerance)과 GVHD의 지속적인 발달이 초래되었기 때문이다.

현재, HUMAMICE 라인은 B2m의 녹아웃을 통한 마우스 class I의 제거와 함께 MHC class II가 제거되어 있는 반면, C57BL/6 유전적 배경 위에 HLA A-2 (class I)과 HLA-DR1 (class II)를 동시에 발현하고 있다 [41]. HUMAMICE는 마우스 perforin, IL2Receptor γ chain이 녹아웃되어 있고 Rag2 녹아웃을 통해 T, B 세포가 결손 되어 있어, 인체 PBMC를 인젝션 한 후 명백한 GVHD가 없이 인체 T 및 B 세포의 이식이 효율적으로 일어난다. PBMC 이식한 HUMAMICE에서 B 세포의 표현형은 PBMC이식한 NSG마우스와 다른 것으로 보고되었다. Hepatitis B백신 접종 후 IgG생산할 수 있는 B 세포의 빈도가 증가되었다고 하는데, 이는 사용한 PBMC 공여자의 수가 제한되어 있어 이것들이 공여자 특이적인지 또는 모델 특이적인 표현형인지 명확하지 않다 [1]. 이러한 제한에도 불구하고 HUMAMICE를 통해, 마우스 MHC class I과 II의 녹아웃 위에 인간 HLA class I과 II가 발현하는 것은 GVHD를 최소한도로 유지하는 인간화마우스 생산 플랫폼으로 제공될 것이다.

2.5.  PBMC 인간화 모델 연구에 대한 미래 방향

이상으로 인간화마우스 모델을 개선해 왔거나 또는 개선할 수 있는 유전변이를 제시하였다. 한 종류의 마우스 안에서 각각의 유전적인 수정의 조합은 추가로 개선되는 모델에서 효과적인 것으로 증명되어 왔다. 예를 들면, MISTRG 마우스에 IL6 발현을 추가하는 것은 MISTRG 모체 라인의 골수 이식을 유지하는 반면, 체액반응을 증가시켜 주었다 [42]. 추가 조합은 PBMC 인간화 모델에서 이식과 형태를 증가시키는데 유용할 것으로 보인다. 현재의 PBMC 모델의 추가 개량은 NSG class I/II 녹아웃 유전적 배경에서 인간 HLA class I/II의 발현을 삽입하는 것이다. 이 새로운 마우스는 MHC가 일치하는 PBMCs를 이식하였을 때, GVHD가 줄어들 것이고, 순환하는 항체의 안정성을 초래하는 B2m/FcRn을 발현할 것이며, NSG에 결여된 마크로파지와 DC 성분을 가질 것이고, NOD 유전적 배경의 특징인 인간 면역관용 SIRPα 다형성을 발현할 것이다 [1].

논의한 바와 같이, PBMC 인간화 모델 내에 인간 사이토카인 발현이 추가되는 것이 효과가 있다는 보고는 없는데, 이것은 주로 연구 보고가 적어서 그럴 것 같다. PBMC 인간화마우스 모델에 인간 사이토카인을 추가하는 것이 유익하다고 암시하는 연구는 몇 가지 있다. PBMC 이식마우스에 IL15의 superagonist을 외부에서 주입하는 것이 NK 활성을 증가시켰다 [33]. 그러나 말초 NK 수의 변화는 보고되지 않았다. 추가 연구에서, 연구자들은 인간 PBMCs를 NSG SGM3마우스에 주입하여, T 세포 활성과 IL17 생산을 보고하였으나 골수 성분에 미치는 영향을 기술한 data는 없었다 [43]. NK와 골수 성분이 처음 이식한 것의 작은 분획을 이루고, 적절한 사이토카인 환경의 존재 하에 골수세포의 생존이 증가된 것이 관찰된 것 같다. 증식과 확장이 결여되어 있고, NK와 골수 성분을 확장하거나 수를 증가시키는 대안은 연구될 필요가 있고, PBMC 인간화마우스에 IL6를 추가하는 것이 B 세포 클래스 전환과 활성에 도움이 될 것이다. 이상 언급한 사이토카인들의 유전자의 안정적인 발현은 가장 탄탄한 종합적인 영향을 미칠 것이며, 재조합단백질의 주입 또는 벡터(vector)에 의한 발현은 원하는 결과를 생산할 것이다. 끝으로, 림프조직 유도체 특이적인 IL2Rγ의 발현은 PBMC 인간화마우스에서 적절한 항원 제시와 T 세포 priming에 도움이 될 것이다 [1].

오늘날, 환자 특이적 면역반응을 보이는 마우스 모델을 확보하기는 어렵다. CD34 및 BLT 모델은 여러 가지 제한 요소, 즉 환자 조혈모세포의 확보의 어려움 그리고 대리모델에서 환자의 면역시스템을 구성하는데 필요한 시간 부족으로 인해 맞춤의료의 대리모델로 이용되기는 쉽지 않을 것이다. 반면, PBMC 모델은 면역이식의 범위가 좁지만, 위급한 경우에는 절대적인 고려 사항이 될 것이다. 물론 PBMC 모델에서 면역이식을 넓히고 관련성을 향상시키는 추가 마우스 모델이 필요하지만, 환자 PBMCs는 쉽게 확보할 수 있으며, 채취 시 공여자 면역상태가 온전하게 남아 있고, 인간 면역세포가 대리 모델에서 교육받아야 하는 HSC 이식 모델에 비교하여 PBMC 모델은 임상적으로 보다 적절한 모델을 제공할 것이다.

3.   결론

이상으로 PBMC 인간화마우스에 대해 최신 지견을 포함하여 살펴보았다. 차세대 항암제로 각광을 받고 있는 면역항암제는 인간항체가 대부분이므로 면역항암제의 정확한 효능을 평가하기 위해서는 인간화마우스가 반드시 필요하다. 왜냐하면, 일반 마우스에서의 효능평가 결과는 임상에서 그대로 적용되지 않기 때문이다. 일반 마우스에서의 효능평가 결과가 임상에서 그대로 반영되지 않는 이유는 종간의 차이에 기인하는데, 그 대부분은 면역 시스템, 특히 선천성 면역 시스템의 차이에서 기인한다 [44, 45]. 따라서 비임상 동물실험결과가 임상에 반영되도록 종간의 차이를 최소화한 실험동물을 개발하는 것이 필요한데, 오늘날 인간화마우스가 최적의 실험동물인 것으로 알려져 있다. 앞에서 기술한 바와 같이 면역부전마우스에 인체면역세포를 이식한 인간화마우스가 연구 개발되어 있고 PBMC 모델의 문제점인 GVHD를 해결하는 연구 동향에 대해 자세히 보고되어 있다. 그럼에도 불구하고 아직도 개선해야 할 문제점이 있지만 향후 보다 정교한 인간화 모델링을 통해 보다 진보된 인간화마우스가 연구현장에 제공될 수 있을 것으로 기대한다.

4.   참고문헌

[1]   Morillon, YM et al. The Development of Next-generation PBMC Humanized Mice for Preclinical Investigation of Cancer Immunotherapeutic Agents ANTICANCER RESEARCH (2020) 40: 5329-5341

[2]   Audige A et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hem- atopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunol (2017) 18: 28

[3]   Wang M et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunother- apy FASEB J. (2018) 32(3): 1537–1549

[4]   Bosma GC et al. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature (1983) 301: 527-530

[5]   McCune JM et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differenti- ation and function. Science. (1988) 241:1632-1639

[6]   Mosier, D.E et al. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunode- ficiency. Nature (1988) 335, 256.

[7]   Shultz LD et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Im- munol. (1995) 154(1):180-91

[8]   Shultz LD et al. Humanized mice in translational biomedical research. Nat. Rev. Immunol. (2007) 7:118–30

[9]   Gellert M. et al. V(D)J recombination: RAG proteins, repair factors, and regulation. Annu. Rev. Bio- chem. (2002), 71:101–32

[10]  Ito M et al. NOD/SCID/γ_cnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood (2002) 100:3175–82

[11]  Shultz LD et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. (2005) 174:6477–89

[12]  Traggiai E et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science (2004) 304:104–7

[13]   Bak IS et al. Two base pair deletion in IL2 receptor γ gene in NOD/SCID mice induces a highly severe im-

munodeficiency. Laboratory Animal Research (2020) 36:27

[14]   Takenaka K et al. Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells. Nat.

Immunol. (2007) 8:1313–23

[15]  Herndler-Brandstettera H, D et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. PNAS, (2017) 114(45)

[16]  Rongvaux A et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol (2014) 32:364–372

[17]  Strowig, T et al. Transgenic expression of human signal regulatory protein alpha in Rag2(-/-)gamma(-/-)(c) mice improves engraftment of human hematopoietic cells in humanized mice. Proc. Natl. Acad. Sci.USA (2011) 108, 13218–13223

[18]  Yamauchi, T et al. Polymorphic SIRPA is the genetic determinant for nod-based mouse lines to achieve efficient human cell engraftment. Exp. Hematol. (2013) 41, S34

[19]  Brehm MA et al. Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function fol- lowing engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression FASEB J. (2019) 33(3): 3137–3151

[20]  King MA et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clin Exp Immunol. (2009) 157(1): 104–118

[21]   In Mouse Models for Drug Discovery, Vol. 602, (Proetzel, G., and Wiles, M. V., eds.), pp. 105–117, Springer,

Amsterdam

[22]  Morillon YM et al. The Use of a Humanized NSG-b2m⁻/− Model for Investigation of Immune and Anti- tumor Effects Mediated by the Bifunctional Immunotherapeutic Bintrafusp Alfa. Front. Oncol., (2020) 10/ Article 549

[23]  Yaguchi T et al. Human PBMC-transferred murine MHC classI/II-deficient NOG mice enable long-term evaluation of human immune responses. Cellular & Molecular Immunology (2018) 15, 953–962

[24]  Ka Y et al. Improved engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NOG MHC double knockout mice generated using CRISPR/Cas9. Immunology Letters (2021) 229, 55-61

[25]  Ashizawa T et al. Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. (2017) 23(1):149-158

[26]   Anderson DM et al. Functional characterization of the human interleukin-15 receptor alpha chain and

close linkage of IL15RA and IL2RA genes. J Biol Chem (1995) 270(50): 29862-29869

[27]  Mosmann TR et al. Species-specificity of T cell stimulating activities of IL 2 and BSF-1 (IL 4): comparison of normal and recombinant mouse and human IL 2 and BSF-1 (IL 4). J Immunol (1987) 138(6):1813-1816

[28]  Meazza R et al. Role of common-gamma chain cytokines in NK cell development and function: perspec- tives for immunotherapy. J Biomed Biotechnol (2011) 861920-861920

[29]  Tam YK et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suit- able for adoptive cellular immunotherapy. Hum Gene Ther (1999) 10(8): 1359-1373

[30]  Kennedy MK et al. Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15- deficient mice. J Exp Med (2000) 191(5):771-780

[31]  Chen Q et al. Expression of human cytokines dramatically improves reconstitution of specific human-blood lineage cells in humanized mice. Proc Natl Acad Sci USA (2009) 106(51): 21783-21788

[32]  Matsuda M et al. Human NK cell development in hIL-7 and hIL-15 knockin NOD/SCID/IL2rgKO mice. Life Sci Alliance (2019) 2(2): e201800195

[33]  Seay K et al. In vivo activation of human NK cells by treatment with an interleukin15 super agonist po- tently inhibits acute in vivo HIV-1 infection in humanized mice. J Virol (2015) 89(12): 6264-6274

[34]  Geller MA and Miller JS. Use of allogeneic NK cells for cancer immunotherapy. Immunotherapy (2011) 3(12): 1445-1459

[35]  Jochems C et al. An NK cell line (haNK) expressing high levels of granzyme and engineered to express the high affinity CD16allele. Oncotarget (2016) 7(52): 86359-86373

[36]  Coughlan AM et al. Myeloid engraftment in humanized mice: Impact of granulocyte-colony stimulating factor treatment and transgenic mouse strain. Stem Cells Dev (2016) 25(7): 530-541

[37]  Billerbeck E et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells inhuman stem cell factor-, gran- ulocyte-macrophage colony stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCIDIL2Rγ(null) human- ized mice. Blood (2011) 117(11): 3076-3086

[38]  Beyer AI and Muench MO. Comparison of human hematopoietic reconstitution in different strains of im- munodeficient mice. Stem Cells Dev (2017) 26(2): 102-112

[39]  Wunderlich M et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PloSOne (2018) 13(12): e0209034-e0209034

[40]  Ye C et al. Increased sensitivity for detecting cytokine release syndrome with cancer immunotherapy using a PBMC humanized NSG-SGM3 mouse model (abstr 3902). Proceedings of the 2019 American Association for Cancer Research (AACR) Annual Meeting, Cancer Res 79 (13 Suppl)

[41]  Zeng Y, et al. Creation of animmunodeficient HLA-transgenic mouse (HUMAMICE) and functional valida- tion of human immunity after transfer of HLA matched human cells. PloS One (2017) 12(4): e0173754- e0173754

[42]  Yu H et al. A novel humanized mouse model with significant improvement of class-switched, antigen-spe- cific antibody production. Blood (2017) 129(8): 959-969

[43]  Perdomo-Celis F et al. High activation and skewed T cell differentiation are associated with low IL-17A lev- els in a hu-PBL-NSG-SGM3 mouse model of HIV infection. Clin Exp Immunol (2020) 200(2): 185-198

[44]   Haley PJ. Species differences in the structure and function of the immune system.

Toxicology. (2003) 188(1):49-71

[45]  Zschaler J et al. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immu- nol. (2014) 34(5):433-54